Ny IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) dia analogue amin'ny substrate β-galactosidase, izay tena mora voatarika. Eo ambany fitarihan'ny IPTG, ny inducer dia afaka mamorona complexe miaraka amin'ny protein repressor, ka miova ny firafitry ny protein repressor, ka tsy afaka miaraka amin'ny gène kendrena izy, ary maneho tsara ny gène kendrena. Koa ahoana no tokony hamaritana ny fifantohan'ny IPTG mandritra ny andrana? Arakaraka ny lehibe kokoa ve no tsara kokoa?
Voalohany, andeha hojerentsika ny fitsipiky ny fampidirana IPTG: Ny operon (singa) lactose an'ny E. coli dia misy gène ara-drafitra telo, Z, Y, ary A, izay mandika ny β-galactosidase, permease, ary acetyltransferase. Ny lacZ dia mamadika ny lactose ho glucose sy galactose, na ho allo-lactose; ny lacY dia mamela ny lactose ao amin'ny tontolo iainana handalo amin'ny fonon'ny sela ary hiditra ao amin'ny sela; ny lacA dia mamindra ny vondrona acetyl avy amin'ny acetyl-CoA mankany amin'ny β-galactoside, izay misy ny fanesorana ny vokatry ny poizina. Ho fanampin'izany, misy ny filaharan'ny fiasana O, ny filaharan'ny fanombohana P ary ny gène mpandrindra I. Ny kaody gène I dia proteinina mpamoritra izay afaka mifamatotra amin'ny toerana O amin'ny filaharan'ny mpandraharaha, mba ho voafehy sy hovonoina ny operon (meta). Misy ihany koa ny toerana fifamatorana ho an'ny toerana fifamatorana proteinina mpikatroka gène catabolic-CAP eo ambonin'ny filaharan'ny fanombohana P. Ny filaharan'ny P, ny filaharan'ny O ary ny toerana fifamatorana CAP miaraka dia mamorona ny faritra mpandrindra ny operon lac. Fehezin'ny faritra mpanara-maso iray ihany ireo fototarazo mpamoaka kaody an'ireo anzima telo ireo mba hahazoana ny fanehoana mirindra ireo vokatra avy amin'ny fototarazo.
Raha tsy misy laktose, dia ao anatin'ny toetry ny famoretana ny lac operon (meta). Amin'izao fotoana izao, ny lac repressor asehon'ny filaharan'ny I eo ambany fifehezan'ny filaharan'ny mpandrindra PI dia mifamatotra amin'ny filaharan'ny O, izay manakana ny RNA polymerase tsy hifamatotra amin'ny filaharan'ny P ary manakana ny fanombohana ny fandikana; rehefa misy laktose, dia azo atao ny mandrisika ny lac operon (meta). Ao amin'ity rafitra operon (meta) ity, ny tena mpanentana dia tsy ny laktose mihitsy. Miditra ao amin'ny sela ny laktose ary fehezin'ny β-galactosidase mba hovaina ho allolactose. Ity farany, amin'ny maha-molekiola mpanentana azy, dia mifamatotra amin'ny proteinina mpanentana ary manova ny endriky ny proteinina, izay mitarika amin'ny fisarahana ny proteinina mpanentana amin'ny filaharan'ny O sy ny fandikana. Ny Isopropylthiogalactoside (IPTG) dia manana fiantraikany mitovy amin'ny allolactose. Mpanentana mahery vaika izy io, izay tsy voaovain'ny bakteria ary tena marin-toerana, ka ampiasaina betsaka any amin'ny laboratoara.
Ahoana no hamaritana ny fifantohana tsara indrindra amin'ny IPTG? Raiso ho ohatra ny E. coli.
Ny karazana E. coli BL21 novokarina ara-jenetika misy pGEX recombinant tsara (CGRP/msCT) dia nampidirina tao anaty ranoka LB misy 50μg·mL-1 Amp, ary novolena nandritra ny alina tamin'ny 37°C. Ny kolontsaina etsy ambony dia nampidirina tao anaty tavoahangy 10 misy ranoka LB vaovao 50mL misy 50μg·mL-1 Amp amin'ny tahan'ny 1:100 ho an'ny kolontsaina fanitarana, ary rehefa 0.6~0.8 ny sandan'ny OD600, dia nampiana IPTG tamin'ny fifantohana farany. Izany dia 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Rehefa avy nampidirina tamin'ny mari-pana mitovy sy fotoana mitovy, dia nalaina avy tao ny 1 mL amin'ny vahaolana bakteria, ary nangonina tamin'ny alalan'ny centrifugation ireo sela bakteria ary nojerena tamin'ny SDS-PAGE mba handinihana ny fiantraikan'ny fifantohana IPTG samihafa amin'ny fanehoana proteinina, ary avy eo dia mifantina ny fifantohana IPTG manana fanehoana proteinina lehibe indrindra.
Aorian'ny fanandramana dia ho hita fa tsy dia lehibe araka izay azo atao ny fifantohan'ny IPTG. Izany dia satria ny IPTG dia manana poizina sasany amin'ny bakteria. Ny fihoarana ny fifantohana dia hamono ny sela ihany koa; ary amin'ny ankapobeny, manantena isika fa arakaraka ny maha betsaka ny proteinina mety levona ao amin'ny sela no tsara kokoa, fa amin'ny tranga maro rehefa avo loatra ny fifantohan'ny IPTG dia hisy fampidirana betsaka miforona. Ny vatana, saingy mihena ny habetsahan'ny proteinina mety levona. Noho izany, ny fifantohan'ny IPTG mety indrindra dia matetika tsy ny lehibe no tsara kokoa, fa ny ambany kokoa ny fifantohana.
Ny tanjon'ny fampidirana sy fambolena karazana proteinina novaina fototarazo dia ny hampitombo ny vokatra azo avy amin'ny proteinina kendrena sy hampihena ny fandaniana. Ny fanehoana ny fototarazo kendrena dia tsy vitan'ny hoe voakasiky ny anton-javatra ao amin'ny karazana sy ny fanehoana ny plasmid, fa koa ny toe-javatra ivelany hafa, toy ny fifantohan'ny inducer, ny mari-pana fampidirana ary ny fotoana fampidirana. Noho izany, amin'ny ankapobeny, alohan'ny hanehoana sy hanadiovana proteinina tsy fantatra, dia tsara kokoa ny mandinika ny fotoana fampidirana, ny mari-pana ary ny fifantohan'ny IPTG mba hisafidianana ny fepetra mety sy hahazoana ny vokatra tsara indrindra amin'ny fanandramana.
Fotoana fandefasana: 31 Desambra 2021